目前，基因組編輯技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個方面，許多實驗室使用該技術(shù)創(chuàng)制了許多突變體材料。但是，對基因編輯材料的篩選和鑒定工作費時費力，而使用一代測序的方法（Sanger測序）鑒定突變體材料效率低而且價格昂貴，無法大規(guī)模的對突變材料進行鑒定分析。因此，急需建立一個高通量、低成本的基因編輯個體篩選方法。而二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing，NGS）不僅大大降低了測序成本，同時還大幅提高了測序通量，并且保持了高準(zhǔn)確性。使用NGS技術(shù)對基因編輯材料進行鑒定分析是一個理想的方法。

原理簡介及步驟

基于多重PCR建庫技術(shù)，對靶標(biāo)區(qū)間進行兩輪PCR來達到建庫和富集的目的（如下圖所示）。基本的實驗步驟如下：
1、針對靶位點區(qū)間設(shè)計特異性引物，可以在上下游特異性引物帶上barcode序列，方便多樣品混合；
2、利用步驟1針對靶位點所設(shè)計的特異性引物，對目的片段進行首輪PCR，獲得目的片段；
3、以步驟2中擴增獲得片段為基礎(chǔ)，進行第二輪PCR擴增，加上測序接頭；
4、混樣后，即可送高通量測序；
5、對測序結(jié)果進行分析。

  多重PCR建庫流程

我司優(yōu)勢及特點

簡單、便捷：客戶只需要提供原始的材料（植物組織、動物細(xì)胞組織等）；
兼容：測序數(shù)據(jù)不僅可以在我司進行分析解讀，也適用于其他分析平臺如Hi-TOM網(wǎng)站（http://www.hi-tom.net/hi-tom/）；
精準(zhǔn)：測序數(shù)據(jù)通量高、數(shù)據(jù)大，可得到最真實的結(jié)果。

一代與二代測序鑒定突變體的方法比較

適用范圍

1、適用于動植物、微生物等基因編輯材料的鑒定分析；
2、適用于需要對大批量基因編輯樣品進行檢測分析；
3、適用于鑒定分析敲除效率低的編輯系統(tǒng)，如先導(dǎo)編輯（Prime editor，PE）系統(tǒng)，可以極大的節(jié)省成本；
4、可以為開發(fā)新的編輯系統(tǒng)檢測編輯效率提供服務(wù)。

客戶下單及項目信息填寫

在我司官網(wǎng)http://plant.biorun.com/進行注冊或登錄，請客戶按照頁面提示填寫：
1、項目名稱、選擇項目類型、填寫個人信息及聯(lián)系方式進行預(yù)提交；
2、提交項目所需要的具體信息，主要是什么類型的編輯材料、樣品總數(shù)、檢測區(qū)域基因組。

結(jié)題標(biāo)準(zhǔn)

測序結(jié)果完整（reads數(shù)在102&拆分有數(shù)據(jù)）。

實驗交付內(nèi)容

1.測序結(jié)果：測序結(jié)果匯總表（表格將孔編號與樣品及擴增靶標(biāo)進行對應(yīng)），靶標(biāo)及檢測引物、目標(biāo)基因組序列，
實驗報告：需注明檢測總數(shù)及每個樣品的編號，檢測位點說明。

收樣標(biāo)準(zhǔn)

實驗結(jié)果

1、提供每個樣品的原始測序數(shù)據(jù)；
2、由本公司建立的分析方法解讀的分析結(jié)果：序列表（包含每個樣品的支持reads數(shù)、突變情況和序列）；
3、提供Hi-TOM網(wǎng)站的解讀結(jié)果；
4、可根據(jù)客戶需求，提供每個樣品的復(fù)核比對結(jié)果圖片。

植物組織樣品取樣建議

核酸提取質(zhì)量與物種及組織部位、采集方法及保存狀態(tài)、提取方法及操作、實驗器材環(huán)境等因素息息相關(guān)，為保障獲得相對較高質(zhì)量的核酸，請務(wù)必按照以下指導(dǎo)原則準(zhǔn)備樣本。
1、液氮速凍法
①  植物材料取材后用清水將材料表面的灰塵及泥土沖洗干凈，吸干材料表面的液體。
②  植物組織樣品取樣重量≥200mg，將樣品分割成50~100mg左右的小塊，放入干凈的離心管或帶螺紋旋蓋的保存管中，立即使用液氮速凍。
③  轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運輸寄送。
2、商用核酸保護液保存法
由于植物含細(xì)胞壁，從已有經(jīng)驗看來，RNAlater之類的核酸保護液難以充分滲透，對于植物樣品提取效果較差，不建議使用；若條件有限，只能使用核酸保護液，請嚴(yán)格按照相應(yīng)的產(chǎn)品使用說明操作。盡量使組織塊尺寸保持在5mm左右，過小不利于樣本收集，過大則保護液不能均勻滲透到組織細(xì)胞內(nèi)。
對于多糖多酚豐富的植物樣本（特別是木本類植物），需暗處理24-48小時后再取樣。

注意事項

1、組織速凍時間：組織離體后，胞內(nèi)核酸便開始降解，尤其是RNA，故采集時，目的組織離體后，需立即速凍，建議5min內(nèi)完成，越快越好。
2、組織送樣量：送樣量過少或過多均不利于提取實驗，下限為建議量的一半，上限為建議量的3倍。
3、組織保存管的選擇：所有組織樣品務(wù)必使用離心管或螺紋管保存，切勿直接裝入密封袋保存（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）。
4、組織樣品保存方法選擇：首選液氮速凍；沒有液氮條件的，可直接放入-80℃冰箱凍存。
5、凍融組織：組織凍存后，一旦凍融，RNA降解概率大于80%，幾乎不可能提取成功，此類組織不建議送樣。送樣前確保組織未發(fā)生過凍融情況。
6、對于同一個組織樣品需要同時提取DNA和RNA的，請務(wù)必分成兩管分批次送樣。